Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) antibakterieller Mittel durch Verdünnung Brühe

Einführung

Broth-Verdünnung ist eine Technik, in der den Behälter in stufen identische Volumina der Brühe mit antimikrobiellen Lösung halten (in der Regel geometrisch) steigende Konzentrationen sind mit einer bekannten Anzahl von Bakterien beimpft.

Broth microdilution bezeichnet die Leistung des Bouillonverdünnungstest in Mikroverdünnungsplatten mit einer Kapazität von ≤ # x200a; 500 & mgr; l pro Vertiefung.

Die Methoden, die in diesem Dokument beschrieben sind, die hauptsächlich für die Prüfung von Reinkulturen von aeroben Bakterien, die durch Inkubation über Nacht auf Agar leicht angebaut werden und die wachsen gut in Mueller-Hinton-Brühe mit minimaler Ergänzung. Die Brühe Verdünnungsverfahren in diesem Dokument beschriebenen sind im Wesentlichen die gleichen wie die in vielen Ländern, darunter Frankreich eingesetzt [1], Deutschland [2], Schweden [3], Großbritannien [4], und die Vereinigten Staaten von Amerika [5]. Alle diese Verfahren basieren auf jene, die von Ericsson und Sherris [6].

Kationen ergänzte Mueller-Hinton-Bouillon ist das am weitesten verbreitete Medium international für Methoden Brühe Verdünnung. Es ermöglicht ein gutes Wachstum der meisten nonfastidious Krankheitserreger und ist in Antagonisten im Allgemeinen gering. Mueller-Hinton-Brühe, die die Anforderungen der Norm erfüllt NCCLS [5] wird das Referenzmedium betrachtet.

Ergänzungsmittel sollen nicht, es sei denn, die für das Wachstum des Testorganismus verwendet werden. Verschiedene Ergänzungen wurden für anspruchsvolle Organismen und Vergleichsdaten über die Leistung nötig sind, um verwendet. Defibriniertes Blut oder lysiert (LB) wird bei 3-5% v / v für anspruchsvolle Streptokokken üblicherweise zugegeben. LB bei 3-5% und 20 mg / L β-NAD für Haemophilus spp üblicherweise zugegeben.

Antimikrobielle Wirkstoffe

Reines antimikrobielle Pulver muss direkt vom Hersteller oder von kommerziellen Quellen erhalten werden. Der Agent muss mit einer Chargennummer, Potenz (ug oder Internationalen Einheiten (IE) pro mg Pulver oder als Prozentsatz Wirkstoff), ein Ablaufdatum und Einzelheiten zu den empfohlenen Lagerbedingungen geliefert werden. Store Pulver in verschlossenen Behältern im Dunkeln bei 4 ° C mit einem Trockenmittel, wenn nicht anders vom Hersteller empfohlen. Idealerweise sollten hygroskopische Mittel in Aliquots dispensiert werden, von denen einer auf jedem Test Gelegenheit verwendet wird. Lassen Sie Behälter auf Raumtemperatur erwärmen, bevor sie zu öffnen Kondensation von Wasser auf dem Pulver zu vermeiden.

Herstellung von Stammlösungen

Verwenden Sie einen kalibrierten Analysenwaage antimikrobielle Mittel zu wiegen. Allowance für die Wirksamkeit des Pulvers kann durch Verwendung der folgenden Formel durchgeführt werden:

Die Konzentrationen der Stammlösungen sollten 1000 mg / l oder mehr, obwohl die Löslichkeit von einigen Agenten zu begrenzen wird. Die tatsächlichen Konzentrationen der Stammlösungen hängen von dem Verfahren zur Herstellung von Arbeitslösungen. Mittel sollten in sterilem destilliertem Wasser gelöst und verdünnt werden, wenn der Hersteller nichts anderes ergibt. Einige Agenten erfordern alternative Lösungsmittel (Tabelle 1).

Tabelle 1 Lösungsmittel und Verdünnungsmittel für die Herstellung von Stammlösungen von antimikrobiellen Mitteln andere Lösungsmittel als Wasser erfordern,

Die halbe Volumen Wasser, ein minimales Volumen 0,1 m Milchsäure oder 0,1 m
HCl zu lösen, dann auf ein Gesamtvolumen mit Wasser aufgefüllt.

Herstellung von Arbeitslösungen

Brühe Verdünnung

Tabelle 2 veranschaulicht ein Verfahren zur Herstellung dieser Verdünnungen vor. Ein Minimum von 1 ml jeder Verdünnung pro Röhrchen oder Fläschchen wird für den Test erforderlich. Da das antimikrobielle Mittel in der Regel in sterile Brühe verdünnt wird dann mit Brühe mit Mikroorganismen beimpft gemischt werden Verdünnungen auf das Doppelte der gewünschten Endkonzentration hergestellt.

Tabelle 2. Herstellung von Verdünnungen von Mitteln zur Verwendung in Brühe Verdünnung Empfindlichkeitstests. Geändert von Ericsson und Sherris [6]

antimikrobielle
Konzentration (mg / l)
in Stammlösung

Volume Lager
Lösung (ml)

Broth microdilution

Vorbereitung des Inokulums

Broth Kulturverfahren

Colony Suspensionsverfahren

Die Kulturen müssen weniger als 30 Stunden alt. Die Kolonien werden mit einer Schleife und das Wachstum steriler Brühe oder Kochsalzlösung überführt berührt. Die Suspension wird eingestellt, um eine Trübung äquivalent zu derjenigen eines 0,5 McFarland-Standard zu geben, wie oben für die Kulturbrühe Verfahren beschrieben.

Für alle die genaue Konzentration der Zellen in der Endbeimpfung Organismen wird auf den Zustand der Kultur abhängen. Dieser Effekt ist für anspruchsvolle Organismen wie Haemophilus spp am stärksten ausgeprägt. und Streptococcus pneumoniae, wo die Verwendung von älteren Kulturen signifikant die Anzahl der lebenden Zellen in der Suspension reduzieren. Eine richtig eingestellt Suspension entweder durch Verfahren hergestellt wird etwa 1,5 × 10 8 cfu / ml für die am häufigsten isolierten Organismen enthält. Alternative Methoden, die zuverlässig die korrekten Inokulum erzeugen, sind ebenfalls akzeptabel. Die Laboratorien sollten die Richtigkeit der gewählten Methode gewährleisten. Platten oder Rohre müssen innerhalb von 30 min zu standardisieren das Inokulum beimpft werden lebensfähige Zelldichte aufrecht zu erhalten.

Das Inokulum oben hergestellt wird, in Brühe verdünnt, um eine endgültige Organismus Dichte von 5 × 10 5 cfu / ml (Bereich 3-7 × 10 5 cfu / ml) zu ergeben. Die Verdünnung richtet sich nach dem Verfahren zum Testen verwendet werden, z.B. Übertragung von 0,1 ml der Organismussuspension in ein Röhrchen 9,9 ml der Brühe enthält, wird ein Inokulum Dichte von 1 × 10 6 cfu / ml, was, gibt, wenn sie mit einem gleichen Volumen von antimikrobiellen Lösung in Röhrchen oder Vertiefungen wird in einem abschließenden Inokulum von Ergebnis gemischt 5 × 10 5 CFU / mL. enthaltend 5 × 10 5 cfu / ml für die direkte Inokulation von kommerziell hergestellten getrockneten Platten, Transfer 50 ul der 0,5 McFarland Organismussuspension zu 10 ml Brühe, um eine Impfkultur herzustellen. S. pneumoniae wurde erfordert Transfer von 100 & mgr; l Suspension der äquivalenten 0,5 McFarland zu 10 ml Brühe gefunden endgültige Inokulum von 5 × 10 5 cfu / ml zu erreichen.

Inokulation von Rohren oder Platten microdilution

Ein Volumen von Bakteriensuspension (siehe Herstellung von Inokulum) gleich dem Volumen der verdünnten antimikrobiellen Lösung (Antimikrobielle Mittel sehen) wird zu jedem Röhrchen oder Well antimikrobielles Mittel zugesetzt. Kommerzielle inoculators ist für die Impfung von Mikroverdünnungsplatten zur Verfügung. Im Handel erhältliche getrocknete Platten erfordern in der Regel der Rekonstitution mit 50 & mgr; l bis 200 & mgr; l pro Well des Organismus in geeigneter Brühe. Wenn eines dieser Systeme verwenden, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.

Es wird empfohlen, daß eine Reinheitsprüfung des Inokulums durchgeführt wird, indem eine Probe auf eine Plattierung auf nicht-selektiven Agarplatte und Inkubieren über Nacht.

Inkubation von Rohren und Platten microdilution

Macrodilution Rohre müssen in Polythen-Beutel oder ausgerüstet mit einem dichten Deckel oder Klebedichtung vor der Inkubation, um Austrocknung zu verhindern, verschlossen und microdilution Platten abgedichtet werden.

Die Röhrchen oder Platten bei 35-37 ° C in Luft für 16-20 h für die meisten antimikrobiellen Mittel / Organismus-Kombinationen. Die Inkubationszeit sollte auf 24 Stunden verlängert werden, wenn Haemophilus spp testen. und Streptokokken und bevor die Ergebnisse von Verdacht auf Oxacillin resistenten Staphylokokken oder Glykopeptid resistenten Enterokokken zu interpretieren. Inkubation bei 30-35 ° C wird die Wahrscheinlichkeit der Detektion von Oxacillin Widerstand erhöhen und sollte verwendet werden, wenn Oxacillin Suszeptibilität testen.

Um eine ungleichmäßige Erwärmung zu vermeiden, nicht microdilution Platten mehr als vier hoch stapeln. Platten und Rohre sollen nicht in einem CO 2 -angereicherten Atmosphäre inkubiert werden.

Leseergebnisse

Ergebnisse müssen nur gelesen werden, wenn ein ausreichendes Wachstum des Testorganismus (dh offensichtliche Taste oder bestimmte Trübung in der positiven Wachstumskontrolle), kein Wachstum in der ungeimpften oder negativen Wachstumskontrolle (wo vorhanden), und wenn eine Reinheit Platte, das den Tests zeigt, Organismus war rein. Das Ausmaß des Wachstums in jedem Rohr oder gut mit dem in der positiven Wachstumskontrolle und der MIC als die niedrigste Konzentration des Wirkstoffes im Vergleich aufgezeichnet, die vollständig das Wachstum hemmt, oder, für Sulfonamide, die niedrigste Konzentration, die 80% des Wachstums inhibiert. Wenn Glycopeptid Anfälligkeit von Enterokokken Testen sollte jede schwache Trübung als Wachstums klassifiziert werden.

Testen anspruchsvolle Organismen

Supplementierung des Wachstumsmediums ist notwendig, wie oben beschrieben. Bei der Prüfung von anspruchsvollen Organismen eine angemessene Qualitätskontrolle Organismus muss auch geprüft werden.

Oxacillin Mikros auf Staphylokokken

Der Widerstand gegen Oxacillin kann schwierig sein, zu erkennen. Die folgenden Bedingungen werden Detektion von resistenten Stämmen Hilfe:

1 Einarbeitung von NaCl in einer Endkonzentration von 2% w / v in der Brühe.
2 Verwendung des direkten Suspensionsverfahren zur Herstellung Bakteriensuspensionen, anstatt das Wachstumsverfahren.
3 Inkubation von Tests für eine volle 24 Stunden.
4 Inkubationstemperatur von nicht mehr als 35 ° C.

Tests auf β-Lactamase-produzierenden Organismen

Qualitätskontrolle

Tabelle 3. Ziel MHK (mg / L) für Kontrollorganismen in Kations eingestellt Mueller-Hinton-Brühe

Escherichia coli
ATCC 25922
NCTC 12241
CIP 76.24
DSM 1103

Escherichia coli
ATCC 35218
DSM 5564

Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
NCTC 12934
CIP 54,127
DSM 1117

Staphylococcus aureus
ATCC 29213
NCTC 12973
CIP 103429
DSM 2569

Enterococcus faecalis
ATCC 29212
NCTC 12697
CIP 103214
DSM 2570

ATCC, American Type Culture Collection, 12301 ParklawnDrive, Rockville, MD 20852, USA.

NCTC National Collection of Type Cultures, Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT.

DSM, Deutsche Stammsammlung fûr Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweg, Deutschland.

Für Fosfomycin, Brühe muss mit 25 mg / L Glukose-6-Phosphat ergänzt werden. Agarverdünnung ist die Methode der Wahl für diese Agenten.

Eine relevante QC Stamm sollte jeden Tag getestet werden, die Testprobe durchgeführt. Alle Stämme sollten ausgeführt werden, wenn es zu einer Änderung Tafel in der Partie der Brühe oder Tests.

Testkolonien Kontrollkulturen in der gleichen Weise wie Routine Kulturen. MICs von Kontrollorganismen sollten innerhalb einer zweifachen Verdünnung der in Tabelle 3 angegebenen Werten werden, wenn MICs für Routineempfindlichkeitstests verwendet werden, nicht mehr als 5% der Ergebnisse der Qualitätskontrolle für eine antimikrobielles Mittel / Organismus Kombination sollte außerhalb der erwarteten Bereiche fallen und korrigierende Aktion, wie die Inokulumdichte Überprüfung ist erforderlich, wenn diese Grenze überschritten wird. Darüber hinaus sind die folgenden empfohlen:

1 Jede Kontrolle ohne antimikrobielle Mittel muss ein angemessenes Wachstum von Test- und Kontrollstämmen zeigen.
2 Eine Probe von Inokulum muss auf geeignetem Agar-Medium plattiert werden, um sicherzustellen, dass es rein ist.
3 Überprüfen Sie gelegentlich die Inokulumdichte, indem Keimzahlen.
4 Stellen Sie sicher, konsistentes Lesen von Endpunkten von allen Mitarbeitern eine Auswahl von Tests unabhängig zu lesen.