Labtimes Tipps und Tricks of the Trade Günstig und einfach Dot-Blot-Technik
Während meiner Diplomarbeit, die von Thomas Arendt und Wolfgang Härtig am Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung in Leipzig, Deutschland betreut wurde, hatte ich Gehirnproteine wie Tau und Double zu quantifizieren. Da dies in der Regel durch Western-Blot durchgeführt wird, überprüfte ich alle verfügbaren westlichen Protokolle und hart gearbeitet, läuft sie zu bekommen. Doch so sehr, als ich versuchte, wollen einige Spuren nicht entwickeln und andere ungefärbt blieben nach der Membran Strippen - auch wenn ich den gleichen Antikörper verwendet.
Um diese Probleme zu beheben, die ich getestet zunächst unterschiedliche Bedingungen für die Antikörper-Inkubation. I erhalten eine bessere Färbung durch die Blottingmembran härter in der Antikörperlösung gerührt wird. Leider führte dies zu sehr hohen Antikörper-Verbrauch, so änderte ich meine Strategie und begann in 96-Well-Platten Blottingmembran Konfetti inkubiert. Lasse ich eine acryamide Gellauf für einige Millimeter, abgetupft die Proteine auf eine PVDF-Membran und schneiden die Membran in einzelne „Spuren“ mit einem Skalpell und übertragen das Konfetti in eine 96-well-Platte. I erreicht tatsächlich eine stabile Färbung, wenn ich alle notwendigen Inkubationsschritte innerhalb dieser Platten durchgeführt.
Doch zwei Probleme blieben noch. Zum einen waren die Gassen zu weit in die Vertiefungen in einem Stück zu passen. Zweitens, 34 Proben sind, zu ermöglichen, mindestens eine 4fache Bestimmung, gemacht, um die Membran auf diese Weise Konfetti zu aufwendig herzustellen. Eine Dot-Blot-Vorrichtung wurde in dem Labor und ein Enzym-linked immunoarbsorbent Assay (ELISA) konnte aufgrund der geringeren Antigen-Bindungskapazität von -ELISA-Platten im Vergleich zu PVDF-Membranen nicht verfügbar ist. ELISA Establishing Platten mit einem Fassungs Antikörper wurde zu zeitaufwendig und eine maßgeschneiderte ELISA Kauf für mehrere Tausend Euro war unmöglich.
Also, was getan werden könnte? Nach einigen weiteren Versuchen entwickeln ich ein billiges und ziemlich einfaches Alternative Dot-Blot-Verfahren Proteinproben auf eine PVDF-Membranen Aufnahme qualitativ hochwertige Spots zu übertragen.
Im nächsten Schritt, direkt einzuspritzen die Proteinproben (solubilisiert in Laemmli-Probenpuffer) in das Gel (2 & mgr; l pro Position) eine Mikrospritze (Fig 1 E) verwendet wird. Entfernen des Gitters, nachdem alle Proben Injektion (Fig 1 F) und die Abdeckung die Oberseite des Gels mit einer dünnen Schicht aus Agarose jede Probe Leckage (Fig 1 G) zu verhindern. Entfernen des Gels aus dem Gusskasten und gibt sie in eine Elektrophorese-Rahmen (ein Kasten ohne Boden, beispielsweise aus dem Deckel eines alten Tipbox hergestellt, siehe 1 H). Fixieren den Gelblock an den Rahmen unter Verwendung von Agarosegel (Fig 1 I bis L) und den Rahmen auf eine Blotting-Kassette für Western Blotting Tank Knoten, bevor die Proteine über Nacht bei 100 mA übertragen.