Block, Stock and Barrel - Ein Leitfaden zur Auswahl Ihrer Blocking Buffer - Bitesize Bio
Blockierung ist das wesentliche dritte Rad in jedem Antikörper / Antigen-Verhältnis. Correct Blockierungspuffer können Ihre Antikörper der Fähigkeit, sein Antigen zu binden, perfektionieren, während schlechte Blockierung spezifische Antikörperbindung in der Nähe unmöglich machen kann. Lassen Sie sich nicht schlecht Blockierung ein Stolperstein in der Western-Blot-Experimenten sein - lesen Sie weiter, um herauszufinden, was achieves blockiert und wie man den richtigen Blockierungspuffer für Western-Blot wählen.
Warum müssen Sie blockieren
Pros - Nachteile von 7 Gemeinsamen Blockern
Ihre Wahl eines Blockierungspuffers hängt von drei Dingen: Ihre Antikörper, Ihr Protein von Interesse und Ihre Erkennungssystem. Hier sind 7 gemeinsame Sperrpuffer und einige wichtige Tipps, wie sie zu benutzen:
1) Magermilchpulver
2) Rinderserumalbumin (BSA)
Dies ist eine gereinigtes Albumin enthaltende Fraktion aus Rinderserum und, zusammen mit Magermilchpulver, ist der häufigste Block der Wahl. Im allgemeinen BSA Blockierungspuffer sind bei einer Konzentration von 2-5%. Allerdings unterscheiden sich die Forscher oft die BSA-Konzentration in ihrem Protokoll so wenig wie möglich zu verwenden, weil es teuer sein kann. Während diese BSA in Ordnung ist mit Phosphoproteine zu verwenden, kann es verunreinigende IgG oder Serumproteine enthalten, die Ihre nicht-spezifischen Hintergrundgeräusche geben kann.
3) Fischgelatine
Die Verwendung von Fisch geletin entwickelte sich aus der Verwendung eines früheren Blockierungsmittel, Schweinegelatine. Fischgelatine wird aus der Haut von Kaltwasserfischen gereinigt und hat den praktischen Vorteil von Flüssigkeit auch bei kalten Temperaturen zu bleiben. Es wird bei niedrigeren Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 5% verwendet. Anders als BSA oder Magermilch, Fischgelatine enthält keine Serumproteine, die mit Säugetier-Antikörper kreuzreagieren können, Hintergrundrauschen zu minimieren. Aber Fischgelatine kann nicht verwendet werden, mit Biotin-Nachweissystemen zu blockieren, weil es endogenes Biotin enthält.
4) Normalserum (z. B. fötales Kälberserum, Kaninchenserum, Ziegenserum, etc.)
Vollserum, das eine Mischung von Proteinen enthält, kann auch zu blockieren Ihren Western-Blot-Membran verwendet werden. Normalserum wird weniger häufig als Blockierungsmittel verwendet, weil es wenig praktischen Vorteil gegenüber Magermilch oder BSA bietet und es ist teurer. Normale Serum muss auch bei höheren Konzentrationen verwendet werden (
5-10%). Wie BSA, enthält normales Serum Immunglobuline und Serumproteinen, die mit Säuger-Antikörpern kreuzreagieren können.
5) Gereinigtes Casein
Man könnte sagen, dies ist ein Chip aus dem alten Block ist, da es nur ein gereinigter Milchprotein. Sie können Kasein verwenden, wo Sie Magermilch verwenden würden, aber bewusst sein, dass Kasein das phospoprotein in Vollmilch ist, so dass dieser Puffer ist auch nicht geeignet, wenn Sie Phosphoproteine zu erfassen versuchen.
6) Proprietary Handels Puffer (z. B. Thermo Scientific Superblock)
Diese enthalten in der Regel reine Fraktionen eines Geheimnisses proprietären Protein. Der Vorteil dieser Puffer ist, dass Sie wissen, gibt es keine Phosphoproteine, Immunglobuline, Albumin oder Biotin (die Bösewichte in anderen Blockierungspuffer), aber der Nachteil ist, dass kommerzielle Puffer teurer sind. Protokolle sind zu jedem kommerziellen Puffer spezifisch, so die Empfehlungen des Herstellers konsultieren. Ein großer Profi dieser Blockierungspuffer ist, dass einige von ihnen ziemlich schnell, so dass Sie „schnell aus den Blöcken“ sozusagen und bewegen sich schneller auf Ihre Detektionsschritte sein.
7) Polyvinylpyrrolidone (PVP)
Was Buffer zu verwenden
Oh sie können zu Ihrem Antigen binden! Deshalb müssen Sie manchmal ein paar verschiedenen Blockierungsmittel versuchen.