Die Hemmung von Protein Carbamylierung in Harnstofflösung unter Verwendung von Ammonium enthaltenden Puffer

Harnstofflösung ist eines der am häufigsten verwendeten Proteindenaturierungsmitteln für die Verdauung Protease in Proteom-Studien. Allerdings ist es seit langem erkannt worden, daß Harnstofflösung Carbamylierung an den N-Termini von Proteinen / Peptiden und an den Seitenketten-Aminogruppen von Lysin und Argininresten führen kann. Protein / Peptid Carbamylierung Blöcke Proteaseverdau und wirkt Protein Identifizierung und Quantifizierung in der Massenspektrometrie-Analyse von Peptid-Aminogruppen von Isotopen / isobaren Markierungs Blockieren und Ladungszustände wechselnden Peptid, Retentionszeiten und Massen. Darüber hinaus Protein Carbamylierung während der Probenvorbereitung macht es schwierig, in vivo Protein Carbamylierung zu studieren. In dieser Studie verglichen wir das Peptid Carbamylierung in Harnstofflösungen von verschiedenen Puffern und festgestellt, dass Ammonium-enthaltenden Puffer die wirksamsten Puffer wurden Protein Carbamylierung in Harnstofflösung zu hemmen. Der mögliche Mechanismus der Hemmung durch Carbamylierung Ammoniumpuffer enthält, wird diskutiert, und ein überarbeitetes Verfahren für die Protease-Verdauung von Proteinen in Harnstoff und Ammoniumpuffer enthielt, wurde entwickelt, ihre Anwendung in Proteomikforschung zu erleichtern.

Stichwort: Carbamylierung, Harnstoff, Ammonium mit Puffern, Proteomics, Massenspektrometrie

EINFÜHRUNG

Harnstoff ist das am häufigsten verwendeten Denaturierungsmittel in Proteom-Studien, und es verwendet wird, Protease-Effizienz in Proteinverdauung zu erhöhen. Harnstoff kann auch Proteine ​​solubilisieren durch Verhinderung Proteinfällung und Aggregation [1; 2]. Jedoch bewirkt die Verdauung der Proteine ​​in Harnstofflösung die Carbamylierung von Proteinen / Peptiden. Obwohl in Proteomics Quantifizierung verwendet [3], hat Carbamylierung mehrere Nachteile für Proteomforschung. Erstens, es blockiert die N-Termini von Proteinen und die Seitenketten-Aminogruppen von Lysin und Argininresten in Proteinen / Peptiden und verhindert, dass sie von der weiteren Verwendung, beispielsweise Kopplung an Festphasenträger oder iTRAQ Kennzeichnung [4; 5; 6]. Zweitens verhindert es Proteine, die von vielen enzymatischen Verdauungen, in unvollständig verdaute Peptide führt. Drittens ist es führt zu unerwarteten chromatographische Retentionszeit in Protein / Peptid-Trennung und unpredicted Massen, wodurch die Komplexität der Proben [7] erhöhen. Viertens beeinflusst sie Peptid- und Proteinidentifikation und genaue Quantifizierung durch die Ionisationseffizienz und Signalintensität der erfaßten Spitzen reduzieren [8]. Fünfte, er betrifft die Untersuchung von in vivo Carbamylierung [9], die als wichtige Proteinmodifikation erkannt wurde mit Urämie verbunden ist, schweren Nieren- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen [10; 11; 12]. Daher reduziert und Peptid Carbamylierung von Harnstoff ergebenden verhindert, ist erforderlich, um die Qualität der quantitativen Proteomik-Daten und die Analyse der in vivo-Proteinmodifikation durch Carbamylierung zu verbessern.

In diesem Beitrag berichten wir die Verwendung von Ammonium enthaltenden Puffern Protein / Peptid Carbamylierung in Harnstofflösung zu hemmen. Ammoniumhydrogencarbonat (NH4 HCO3) und zwei andere Ammonium enthaltenden Puffer zeigten bessere Carbamylierung Hemmung Wirkungsgrad als Phosphatpuffer (PB) und Tris-HCl-Puffer. Eine hohe Konzentration an NH4 HCO3-Puffer (1 M) hemmte fast alle Carbamylierung auf Proteine ​​/ Peptide und Humanserum ohne Wirkung auf Trypsin-Verdauung. Noch wichtiger ist, ist NH4 HCO3 Lösung ein häufig verwendeter Puffer in vielen enzymatischen Aufschluß Protokollen und ist daher sehr geeignet für Proteomforschung.

Materialen und Methoden

Chemikalien und Reagenzien

Standardpeptide Angiotensin und Neurotensin, Standard-Protein Rinder- Fetuin, Humanseren (gefrorene Flüssigkeit), Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP), Iodacetamid, Ammoniumbicarbonat, Ammoniumacetat, Triethylammoniumbicarbonat-Puffer und Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri,). Sequencing-Grade-Harnstoff, LC-MS-Grade-Acetonitril (ACN), Trifluoressigsäure (TFA) und Ameisensäure (FA) wurde von Thermo Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ) erworben. Sequencing-grade modifizierte Trypsin wurde von Promega Corp. (Madison, WI) erworben. Der Peptid Standard-Kit für die MALDI-TOF-MS wurde von AB SCIEX (Framingham, MA) erworben. Sep-Pak C18-Säulen (1 cc) wurden von Waters (Milford, MA) erhalten. C18 Zip-Spitzen wurden von Millipore (Bedford, MA) erworben. Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) Matrix wurde von Agilent (Palo Alto, CA) erworben.

Carbamylierung auf Standard-Peptide

Carbamylierung auf einem Standard-Protein

Rinder-Fetuin (40 # X000b5; g) wurde denaturiert und inkubiert in 20 # X000b5; L 8 M Harnstoff in einem der folgenden Puffer: 0,1 M PB, pH 8; 0,2 M Tris-HCl, pH 7,6; 0,2 M NH4 HCO3; und 1 M NH4 HCO3 bei Raumtemperatur für 30 min. Das Protein wurde bei 37 # x000b0 mit 10 mM TCEP reduziert; C für 1 h und alkyliert unter Verwendung von 15 mM Jodacetamid bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln. Die Proben wurden 5-fach mit den jeweiligen Puffern verdünnt, wie oben erwähnt (Endkonzentration von Harnstoff betrug 1,6 M) und wurden mittels Trypsin verdaut (Protein: Enzym, 50: 1, w / w) bei 37 # X000b0; C für 18 Stunden. Dann wurde 10% jeder Probe entsalzt von C18 Zip-Spitze vor der MALDI-TOF-MS-Analyse.

Carbamylierung auf Humanserum

Zwei Mikroliter Humanserum (Sigma) wurde in einem der folgenden Puffer mit 8 M Harnstoff 10fache verdünnt: PB, pH 8; 0,2 M Tris-HCl; 0,2 M NH4 HCO3; und 1 M NH4 HCO3. Nach reduziert und alkyliert, wie oben angegeben, wurden die Proben 5-fach verdünnt mit jedem der durch Verdau gefolgt Puffer mit Trypsin (Protein: Enzym, 50: 1, w / w) bei 37 # x000b0; C für 18 Stunden. Die Proben wurden durch den Einsatz von 1cc C18-Säulen entsalzt und in einer SpeedVac getrocknet. Die getrockneten Peptide wurden in 0,1% TFA für die LC-MS / MS-Analyse resuspendiert.

MALDI-TOF-MS und LC-MS / MS-Analyse

Für MS-Analyse, die oben wurden durch MALDI-TOF-MS (Applied Biosystems 4800) erhaltenen Peptide analysiert. Die Spektren wurden im Reflektormodus erfasst. Die relative Carbamylierung Verhältnis der Peakfläche des carbamylierten Peptid, geteilt durch die Peakfläche von nicht-carbamylierten Peptide verwendet wurde zur Quantifizierung der Peptide carbamylierten verwendet. Für LC-MS / MS-Analyse, 1 # x000b5; g von tryptischen Peptiden, die aus humanen Seren erzeugt wurde durch einen LTQ-Orbitrap Velos Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) analysiert. Die Peptide wurden auf einem Dionex ultimative 3000 RSLCnano System getrennt (Thermo Scientific), bestehend aus einem 75 # X003bc; m # X000d7; 15 cm Acclaim PepMap100 Trennsäule (Thermo Scientific) stromabwärts von einem 2 cm Vorsäule (Thermo Scientific). Die mobile Phase Fließgeschwindigkeit wurde auf 300 Nl / min festgelegt wurde, und von 0,1% Ameisensäure in Wasser (A) und 0,1% Ameisensäure in 95% Acetonitril (B) umfasst. Das Gradientenprofil wurde folgendermaßen bestimmt: 4-35% B für 70 min, 35-95% B während 5 min, 95% B für 10 min und die Äquilibrierung bei 4% B für 15 min. MS-Analyse wurde unter Verwendung eines Orbitrap Velos Pro-Massenspektrometer (Thermo Scientific) durchgeführt. Die Spritzspannung wurde auf 2,2 kV eingestellt. Orbitrap MS1 Spektren (AGC 1 # x000d7; 10 6) 400 bis 1800 m / z bei einer Auflösung von 60K erworben wurden, gefolgt von datenabhängigen HCD MS / MS (Auflösung 7500, die Kollisionsenergie von 45%, die Aktivierungszeit 0,1 ms) von die zehn am häufigsten vorkommenden Ionen eine Isolationsbreite von 2,0 Da verwenden. Ladezustand-Screening wurde aktiviert und nicht zugewiesene einfach geladene Ionen zu verwerfen. Eine dynamische Ausschlusszeit von 35 sec wurde verwendet, um gegen die zuvor ausgewählte Ionen zu unterscheiden.

Datenbanksuche

Resultate und Diskussion

Carbamylierung von Peptid in verschiedenen Puffern mit Harnstoff

Standardpeptide für Peptid Carbamylierung Assay und die Peptidmassen und ihre unmodifizierten carbamylierten Form verwendet.

Um das Ausmaß der Carbamylierung des N-terminalen Aminogruppe und Lysin Aminogruppe in Harnstoff mit verschiedenen Puffern bestimmen wir die relative Carbamylierung Verhältnis unter Verwendung der Peakfläche des carbamylierten Peptid, geteilt durch die Peakfläche von nicht-carbamylierten Peptiden berechnet. Das relative Verhältnis von Carbamylierung reflektiert nicht den Prozentsatz der Carbamylierung eines spezifischen Peptids, da die Ionisierung Effizienzen der carbamylierten und nicht-carbamylierten Formen des gleichen Peptids unterschiedlich sind. Jedoch stellt das relative Verhältnis Carbamylierung ein bequemes Mittel für das Ausmaß der Carbamylierung des gleichen Peptids in verschiedenen Bedingungen zu messen. Die relativen Verhältnisse Carbamylierung beider Peptide in verschiedenen Puffern sind in Abbildung 1 für Angiotensin gezeigt, die eine Aminogruppe an seinem N-Terminus enthält, wobei das relative Verhältnis von Carbamylierung 0,20 und 0,31 in PB-Puffer und 0,2 M Tris-HCl-Puffer, jeweils, wohingegen die relative Carbamylierung Verhältnis drastisch auf 0,036 in 0,2 M NH4 HCO3 Puffer verringert wurde (Fig. 1A und 1C). Für Neurotensin, den Puffer keine Aminogruppe an seinem N-Terminus enthält, tritt die Carbamylierung hauptsächlich an den Lysinresten mit relativer Carbamylierung Verhältnissen von 0,049 und 0,047 in PB-Puffer und 0,2 M Tris-HCl, respectively. Das relative Carbamylierung Verhältnis wird in 0,2 M NH4 HCO3-Puffer (Fig. 1B und 1C), um 0,026 reduziert. Der allgemeine Trend war, dass Carbamylierung häufiger bei der aufgetreten # X003b2; -Aminogruppen von Peptid / Protein-N-Termini als bei der # X003b2; -Aminogruppen von Lysin-Seitenketten, die mit früheren Berichten konsistent ist [9; 16]. Der NH4 HCO3 Puffer versorgt den höchsten Schutz gegen Peptide gegen Carbamylierung unter allen Puffern, die wir getestet haben.

Die Hemmung der Carbamylierung Peptid durch verschiedene Puffer. C für 18 Stunden in verschiedenen Puffern (0,1 M PB, 0,2 M Tris-HCl und 0,2 M NH4 HCO3) mit 1,6 M Harnstoff-Lösung; angiotensin und Neurotensin wurden bei 37 # x000b0 inkubiert. A) Carbamylierung von Angiotensin-Peptid.

Die Wirkung der Temperatur und Harnstoffkonzentration auf Carbamylierung Hemmung durch NH4 HCO3 Lösung wurde ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass, obwohl der NH4 HCO3-Puffer bei 95 # x000b0 zeigte einen wirksamen Schutz auf Peptide im Vergleich zu PB-Puffer selbst; C in 1 h, die relative Carbamylierung Verhältnis dramatisch niedrigeren Temperatur (Tabelle S1) verglichen erhöht. Zum Beispiel verhindert, dass noch 1 M NH4 HCO3 konnte fast vollständig jede N-terminales Peptid Carbamylierung mit Inkubation bei 60 # x000b0; C für 1 Std. Allerdings erreichte die relative Carbamylierung Verhältnis von Angiotensin und Neurotensin 12,2 und 3,7 bei 95 # x000b0; C in 1 h, respectively. Die Harnstoffkonzentration wurde ein weiterer sehr wichtiger Faktor, der den Grad der Carbamylierung Peptids beeinflusst. Die Daten zeigten einen allgemeinen Trend, daß die Carbamylierung von Peptiden mit erhöhter Harnstoffkonzentrationen würden weiterhin steigt, selbst in der Gegenwart von 0,2 M NH4 HCO3-Puffer (Fig. S1). Unter Berücksichtigung aller oben genannten Faktoren aufgeführt, wurde der Schluss gezogen, dass die Carbamylierung an sowohl die N-Termini und Lysinseitenketten von Peptiden in 1 M NH4 HCO3-Puffer mit 1,6 M Harnstoff-Lösung bei 37 # x000b0 vermieden werden könnte, so lange wie 18 h C.

Carbamylierung während der Proteinverdauung in Harnstofflösung

Um zu untersuchen, wurde die Wirkung verschiedenen Puffer auf der Proteinverdauung, eine Standard-Protein Rinder-Fetuin für Trypsinverdaus und Carbamylierung Messung ausgewählt. Fetuin wurde denaturiert (Raumtemperatur für 30 min), reduziert (37 # x000b0; C für 1 h), und alkyliertes (Raumtemperatur 30 min) in 0,1 M PB, pH 8; 0,2 M Tris-HCl, pH 7,6; 0,2 M NH4 HCO3 oder 1 M NH4 HCO3 Puffer mit 8 M Harnstoff, gefolgt von 5-fachen Verdünnung mit dem entsprechenden Puffer (die endgültige Harnstoffkonzentration betrug 1,6 M und die Pufferkonzentration war unverändert) und Trypsin wurden bei 37 für die Verdauung hinzugefügt # X000b0; C für 18 Std. Die Ergebnisse zeigten, dass 16 der 21 theoretischen tryptischen Peptiden (Peptidmassen zwischen 500 und 5000 Da) aus dem Verdau in allen Puffern durch MALDI-TOF-MS (Tabelle S2) festgestellt wurden. Die unerkannten Peptide könnten Glykosylierung (2 Peptide) oder andere unbekannte Modifikationen (3-Peptide) enthalten. Darüber hinaus waren die Profile und die Intensität der MALDI-TOF-MS-Spektren zwischen den Proben in verschiedenen Puffern sehr ähnlich (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigten, dass eine hohe Konzentration von NH 4 HCO 3 Puffer (1M) nicht die Trypsinverdaus von Fetuin beeinflussen.

Um die schützende Wirkung von NH4 HCO3 Puffer auf Peptid zu beurteilen Carbamylierung während der Proteinverdauung, sechs tryptischen Peptide aus Fetuin wurden zur weiteren Analyse ausgewählt, um das relativen Carbamylierung Verhältnis in verschiedenen Puffern auf Basis von N-terminalen Carbamylierung, Lysin Carbamylierung von Peptiden nach tryptischen Verdau zu bestimmen, und Lysin Carbamylierung auf Proteinebene eine verpasste Spaltung von tryptischen Peptide an der carbamylierten Lysin verursacht (Tabelle 2). Zwei der tryptischen Peptide enthalten interne N-terminalen Aminogruppen und Arginin-Reste an dem C-Terminus (Peptid # 1 und # 2 in Tabelle 2), zwei weitere enthalten interne N-terminalen Aminogruppen und Lysin-Reste an ihren C-Termini ( Peptid # 3 und # 4 in Tabelle 2), während die verbleibenden beiden enthalten carbamylierten Lysinreste an den verpassten gespalten Lysinreste, interne N-terminalen Aminogruppen und Argininresten am C-Terminus der tryptischen Peptide (Peptid # 5 und # 6 in Tabelle 2). Die relativen Verhältnisse Carbamylierung am N-Terminus des Peptids # 1 und # 2 waren 0.098 und 0.082 in PB, 0,11 und 0,089 in 0,2 M Tris-HCl-Puffer, 0,016 und 0,012 in 0,2 M NH4 HCO3. und keine Carbamylierung in 1 M NH4 HCO3. jeweils (Fig. 2). Jedoch waren die Gesamt Carbamylierung Verhältnisse der Doppel Carbamylierung tryptischen Peptide sowohl Lysin-Reste an ihrem C-Terminus und die internen N-terminalen Aminogruppen (Peptid # 3 und # 4), enthaltenden 0,10 und 0,089 in PB, 0,12 und 0,095 in 0,2M Tris -HCl-Puffer, 0,021 und 0,013 in 0,2 M NH4 HCO3-Puffer und 0,003 und 0 in 1 M NH4 HCO3-Puffer, jeweils (Fig. 2). Diese Daten zeigten, daß die Carbamylierung an beiden N-terminalen und Lysinreste der Peptide konnte effizient in 1 M NH4 HCO3 Puffer inhibiert werden. Die beiden ausgewählten Peptiden mit internen verpassten gespalten Lysine wurden durch MALDI-TOF-MS detektiert, die vorgeschlagen, dass die Carbamoylierung, die während der Denaturierung, Reduktion und Alkylierungsprozessen war vernachlässigbar, und die Trypsinverdaus war ebenso vollständig in alle auf Proteinebene stattfindet vier Puffer. Die Ergebnisse zeigten, dass NH4 HCO3 Puffer den besten Schutz gegen Carbamylierung auf beiden Protein- und Peptid-Ebenen und 1 M NH4 HCO3 fast vollständig gehemmt Protein- und Peptid-Carbamoylierung zur Verfügung gestellt.

Relative Carbamylierung durch Proteinverdauung in verschiedenen Puffern mit Harnstoff. Rinder- Fetuin wurde denaturiert, reduziert, alkyliert und in verschiedene Puffer (0,1 M PB, 0,2 M Tris-HCl, 0,2 M NH4 HCO3 und 1 M NH4 HCO3) mit Harnstofflösung verdaut.