Eine einfache Methode für die Größe kontrollierten Synthese von Stable oligomere Cluster of Gold
Einführung
Verwendung von Gold Es gibt eine zunehmende Nanopartikel 9,10 in biologischen und chemischen Tests. Trotz der Verfügbarkeit von vielen Quellen für den Kauf von Gold-Nanopartikeln, sie kommen zu einem erheblichen Preis, wenn die Kosten der im Hause Synthese verglichen. Die hohen Kosten für kommerziell erhältliche Nanopartikel macht im Haus Synthese wünschenswert. Unser Verfahren beinhaltet die Synthese von oligomeren Nanocluster, hergestellt von kleinen 2-3 nm sphärischen Golduntereinheiten. Mit allen Vorteilen der klassischen Goldnanopartikel sind oligomere Nanocluster Wahl bevorzugt, wenn es um Permeabilität oder Filtrationsraten-Messungen, weil ihre modulare Struktur ahmt die Struktur von Proteinen kommt.
Derzeit umfassen die häufigsten Ansätze für die im Haus Synthese von Goldnanopartikeln, die Reduktion von Goldchlorid (HAuCl 4) unter wässrigen Bedingungen 11,12. Reduktion von HAuCl 4 mit üblichen Reduktionsmitteln, wie Natriumborhydrid (NaBH4) oder Natriumcitrat, ermöglicht die Herstellung von sphärischen Nanopartikel Goldnanopartikel 13 durch diese Verfahren synthetisiert werden, in ihrer Nutzungs Grßenbereich beschränkt, da sie auf die Anwesenheit von empfindlich Salze in biologischen Puffern als Kerndurchmesser erhöhen. Ein Verfahren ist für die Synthese von Nanopartikeln gelben von 2-3 nm Durchmesser aus der Reduktion von HAuCl 4 mit Natriumthiocyanat unter alkalischen Bedingungen beschrieben 14,15 vorher.
Hier beschreiben wir eine Modifikation dieses Verfahrens, die einen traubenartigen oligocluster des gelben Nanopartikel ohne die Notwendigkeit für zusätzliche Verkappungsmittel erzeugt. Indem einfach die Zeit zwischen der Zugabe der alkalischen Lösung zu HAuCl4 variierender und die anschließende Zugabe von Reduktionsmittel, Natriumthiocyanat, sind wir in der Lage, die sich ergebende Größe der Goldpartikel variieren von
25 nm. Um größere Teilchen herzustellen, wird ein einfaches Add-On-Verfahren kann verwendet werden, um diese oligoclusters durch die Zugabe von Gold-hydroxylierten (HG) zu den synthetisierten oligoclusters in Gegenwart von Natriumthiocyanat zu wachsen. Mit diesen beiden Verfahren sind wir in der Lage oligoclusters zuverlässig zu produzieren eine Reihe Abdeckung von
70 nm. Die Tatsache, dass diese Methode auch die Synthese von hochwertigem Gold oligoclusters unter Benchtop-Bedingungen mit Standardausstattung und eine begrenzten Anzahl von Reagenzien erstreckt gesteuert ermöglicht potentiell die Vorteile von Gold-Nanopartikeln als Forschungswerkzeug für Forscher mit wenig oder gar keiner Erfahrung in der chemischen Synthese.
1. Vorbereitung der Reagenzien
Herstellung von GoldchloridMan löst 1 g Gold (III) -chlorid-Trihydrat in 100 g H2 O 25 mM HAuCl 4 zu geben.
Man löst 3,81 g Borax in 100 g H 2 O 0,1 molaler Borax zu geben (warme ggf. Komplettlösung zu gewährleisten).
Herstellung von NatriumthiocyanatMan löst 8,1 g Natriumthiocyanat in 100 g H2 O 1 molal NaSCN zu geben.
Herstellung von NatriumkarbonatMan löst 5,3 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 100 g H2 O 0,5 molal Na2 CO3 zu geben.
Herstellung von GlutathionMan löst 154 mg an reduziertem Glutathion (GSH) pro 1 ml 0,5 molal Na2 CO3 0,5 molal GSH zu geben.
2. Synthese von Gold-Oligoclusters
Verzögerungszeit Synthese von Gold-OligoclustersIn 59,5 ml H 2 O in einen sauberen 125 ml Wheaton Glasflasche einen Rührstab enthält. Verwenden Sie einen flachen Boden sauber Glasbehälter, aber sicher, dass es sehr sauber ist.
In 7 ml 0,1 molarer Borax und bringt Lösung zu einem kräftigen umrühren.
25 mM HAuCl 4 unter kräftigem Mischen und gewünschte Verzögerungszeit warten (Zugabe von HAuCl4 beginnt die Verzögerungszeit). Verzögerungszeiten werden die Größe des synthetisierten oligoclusters bestimmen, wie in Tabelle 1 gezeigt.
Nach der gewünschten Verzögerungszeit, fügen 700 # X000b5; l von 1 molal NaSCN unter kurzem kräftigem Rühren (1200 Upm für 30 sec).
Entfernen Rührstab und reagieren lassen, geht bis zur Fertigstellung O / N (Größenverteilung des oligoclusters kann weiter dadurch verbessert werden, so dass Gemisch kontinuierlich gerührten O / N, während die Reaktion vollständig abläuft). Sobald Reaktion zum Abschluss gekommen ist, ist die so synthetisierte rohe oligoclusters Wochen stabil.
Add-on-Wachstum von OligoclustersMähdrescher 10 ml as-synthetisierten oligoclusters zu 60 ml HG. Das Verhältnis des so synthetisierten oligoclusters zu HG bestimmt die Größe des resultierenden oligoclusters, die relative Menge an HG erzeugt größere oligoclusters erhöht.
In 900 # X000b5; l von 1 molal NaSCN unter kurzem kräftigem Rühren (1200 Upm für 30 sec).
Lassen Sie die Reaktion vollständig ablaufen O / N gehen (Größenverteilung des oligoclusters kann weiter verbessert werden, indem Mischung kontinuierlich rühren OS / N, während die Reaktion vollständig abläuft).
3. GSH Derivatisierung und Konzentration von Oligoclusters
Fügen Sie 70 ml so synthetisierte rohen oligoclusters (oder oligoclusters vom Add-on-Verfahren) zu einer 70 ml 30 kDa Cutoff Zentrifugalfilter.
Spin für 15 Minuten bei 3000 x g. Dies konzentriert die Partikel bis zu einem Volumen von
Flip-Gerät über und zurückzugewinnen Retentat durch die Vorrichtung 3 min bei 500 x g zu drehen. Wiederhergestellte Volumen sollte
Maßnahme gewonnen Volumen einer Mikropipette.
Hinzufügen eines Volumens von 0,5 molal Glutathion (oder andere thiol) gleich 1/9 dem wiedergewonnenen Volumen konzentrierter oligoclusters (Endkonzentration 50 mmolal GSH).
In all den verdünnten derivatisierten oligoclusters bis 30 kDa Cutoff-Zentrifugalfilter.
Drehe das Zentrifugalfilter für 15 min bei 3.000 x g.
Flip-Gerät über und zurückzugewinnen Retentat durch die Vorrichtung 3 min bei 500 x g zu drehen. Wiederhergestellte Volumen sollte
250 # X000b5; l. Die gewonnenen konzentrierten Partikel sind gebrauchsfertig und sind über Monate stabil bei 4 # X000b0; C.
4. Analyse und Verifikation von Oligocluster Synthese
Gel-Elektrophorese von OligoclustersMischen der synthetisierten oligocluster Zubereitungen 2: 1 mit Ladepuffer, enthaltend 60% Glycerin,
0,15% Bromphenolblau und 150 mmolal GSH (lieferbar von 0,5 molal in 0,5 molal Na2 CO3, gelöst GSH).
Last 30 # X000b5; l auf vorgegossenen Polyacrylamid-Gradientengel (jede kDa) und läuft mit Tris-Glycin-Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, kein SDS verwendet wird) für 26 min bei konstanter Spannung (200 V).
Elektrophorese von GSH derivatisierten OligoclustersDilute GSH derivatisierten oligocluster Herstellung 1: 3 mit H 2 O (typischerweise 2 # X000b5; l GSH-oligoclusters mit 6 # X000b5; l H 2 O).
Mix verdünnt GSH derivatisierten oligoclusters 2: 1 mit Ladepuffer 60% Glycerin enthält,
0,15% Bromphenolblau und 150 mmolal Natriumbicarbonat.
Last 10 # X000b5; l auf vorgegossenen Polyacrylamid-Gradientengel (jede kDa) und läuft mit Tris-Glycin-Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, kein SDS verwendet wird) für 26 min bei konstanter Spannung (200 V).
# X000a0; Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)Zum Waschen oligoclusters 20 verdünnen # X000b5; l konzentrierter oligoclusters mit 0,5 ml H 2 O und Last in einer zu 0,5 ml 30 kDa Cutoff Zentrifugalfilter.
Spin bei 14.000 x g für 10 min.
Entfernen Filtrat und resuspendieren Retentat mit einem frischen 0,5 ml H 2 O
Wiederholen Waschen zweimal für insgesamt 3 Waschungen.
Verdünnen Endretentat 500-fach in H 2 O (oligoclusters sind bereit, an dieser Stelle für die Rasterung).
Glimmentladung Kohlenstoff beschichteten Gitter.
Deposit 0,6 # X000b5; l gewaschener und verdünnt oligoclusters auf ein kohlenstoffbeschichtetes glow entladen Gitter.
Erlauben Gitter an der Luft trocknen für 10 min.
Visualisieren oligoclusters durch TEM bei 100.000fache Vergrößerung. Betreiben Sie bei 80 kV für Bilder hier gezeigt.
Repräsentative Ergebnisse
Die Synthesen von Gold oligoclusters wurden durch Gelelektrophorese (Abbildung 1) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (Abbildung 2) analysiert. Die Größe der GSH-beschichteten oligoclusters kann durch Elektrophorese überwacht werden als größere Partikel wandern weniger und dunkler erscheinen. Darüber hinaus kann die Qualität einer gegebenen Größe Zubereitung durch die Weite der nach der Elektrophorese ersichtlich Band entnommen werden (dh für eine gegebene Größe, Zubereitungen mit schmaleren Größenverteilungen produzieren festeren Bändern als Zubereitungen von gleicher Größe mit breiter Größenverteilung) . Figur 2 beschreibt die Beziehung der Zeitverzögerung (Verzögerungszeit-Methode) oder HG: Samen (Add-on-Methode) oligocluster Größe. Mittlere Durchmesser von TEM berechnet werden verwendet, Verzögerungszeit und HG zu bestimmen: Samen Abhängigkeit Wachstum von oligoclusters für verzögerungszeit und Add-On-Verfahren auf. Ein Flussdiagramm (Figur 3) umreißt das Verfahren für beide Verfahren und eine Tabelle (Tabelle 1) vorhergesagten Parameter oligoclusters Bereitstellen der gewünschten Größe zu erzeugen, werden vorgestellt.
Abbildung 1.Polyacrylamide Gradienten-Gelelektrophorese von oligoclusters durch die Verzögerungszeit und die Add-on-Verfahren gebildet. Oligoclusters durch die Verzögerungszeit erzeugt und die Add-on-Verfahren wurden auf Gradienten-Gelelektrophorese analysiert. Lanes 2-4: oligoclusters nach verschiedenen Verzögerungszeiten gebildet (45, 135, und 405 sec), der zwischen Herstellung der HAuCl4 alkalischen und der Zugabe von NaSCN. Spuren 5-8: oligoclusters durch das Add-on-Verfahren gebildet. Samen wurde durch die Verzögerungszeit-Methode mit 405 sec # x000a0 gebildet; Verzögerung, gekennzeichnet durch # X02193 ;. Verschiedene Mengen von HG wurden für Add-On verwendet. Die Verhältnisse von HG-Lösung (1 mM in Gold) zu Lösung (1 mM in Gold) Samen für die Herstellung jede Probe verwendet angegeben sind, wie 4xHG, 6xHG, 12xHG und 24xHG. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
3,5 nm); a ist der maximale Anstieg der Kerngröße, die durch die Verzögerungszeit verlängert (
20 nm), und b = 0,0021 s -1. (B) Die Durchmesser der oligoclusters nach verschiedenen Verzögerungszeiten gebildet, bevor die Zugabe NaSCN (delay-time-Methode) auf einer linearen Skala dargestellt. (C) Die Durchmesser des oligoclusters nach Zugabe gebildet (Add-on-Methode) von unterschiedlichen Mengen von HG auf vorgeformtes Gold-Samen durch die Verzögerungszeit-Verfahren gebildet mit 405 sec # x000a0; Verzögerungszeit. Wie durch die dicke schwarze Linie dargestellt ist, kann es leicht, dass durch das Add-on-Verfahren gebildet der Durchmesser des oligoclusters ersichtlich ist
wo CHG und cSeeds sind die Konzentrationen von Chlorgoldsäure bei der Herstellung der Lösung von HG in Add-On-Verfahren verwendet, und in oligoclusters durch die Verzögerungszeit-Verfahren zu machen, respectively. Ähnlich VHG und VSeeds sind die entsprechenden Volumina. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung 3.Wall Diagramm der Verzögerungszeit und Add-On-Verfahren zur Herstellung von Gold oligoclusters in verschiedenen Größen. Ablaufdiagramm umreißt die Verfahren zur Synthese von Gold oligoclusters unterschiedlicher Größe unter Verwendung entweder die Verzögerungszeit oder Add-on-Methoden. Die alkalische Lösung aus Chlorogoldsäure ist blau. Die HG ist rot. Die Gold-Nanopartikel-Samen und oligoclusters sind schwarz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
wo CHG und cSeeds sind die Konzentrationen von Chlorgoldsäure bei der Herstellung der Lösung von HG in Add-On-Verfahren verwendet, und in oligoclusters durch die Verzögerungszeit-Verfahren zu machen, respectively. Ähnlich VHG und VSeeds sind die entsprechenden Volumina.
Diskussion
Das Add-on-Methode hat zwei Einschränkungen, von denen die erste ist, die große Reaktionsvolumina erforderlich, bei hohen HG: Samenverhältnisse. Eine zweite Beschränkung auf das Add-on-Verfahren stammt von der oben erwähnten Tatsache, dass die Hydroxylierung von HAuCl4 eine Gleichgewichtsreaktion ist, und geht nicht bis zur Fertigstellung. Die unvollständige Hydroxylierung von HAuCl4 hat minimalen Einfluss auf die Add-on-Reaktion, wenn die Konzentration von oligocluster Samen hoch bleibt. Wenn die Konzentration von oligocluster Samen niedrig sind, wie es der Fall ist, wenn lange Verzögerungszeit und hohe Samen HG verwendet: Samen Verhältnisse kann der Einfluss von nichthydroxyliertem HAuCl4 signifikant. Unter diesen Bedingungen ist HAuCl4 der Lage, die Synthese von neuen oligoclusters nukleieren, in heterogenen Populationen von oligoclusters führt.
Die so synthetisierte oligoclusters durch die Verzögerungszeit oder Add-on-Verfahren hergestellt sind seit Wochen stabil, nur Spuren von Gold-Niederschlag zu entwickeln. Auch nach 300 konzentriert wird klappen die oligoclusters bleiben stabil und widerAggregation. Das Gold oligoclusters beschrieben auch hier hat den zusätzlichen Vorteil, in der Lage, ohne vorherige Derivatisierung konzentriert werden, wodurch teure Derivatisierungsmittel ermöglichen in kleineren Mengen verwendet werden. Nachdem mit Glutathion derivatisiert werden (GSH), Cluster blieb stabil bis zu einem Jahr. GSH-Derivatisierung stellt auch starke negative Ladung 13, der sie widerstehen, wenn die Aggregation macht physiologischen Puffern oder tierischem Plasma ausgesetzt, wodurch sie sich für in-vivo-Experimente macht. Die Derivatisierung kann mit einer Vielzahl von Thiolgruppe enthält Reagenzien erreicht werden.
Die Ansprechbarkeit der oligoclusters der Derivatisierung mit anderen Thiol enthaltenden Molekülen ermöglicht 17,18 bequeme und einfache Modifikation der Oberfläche einschichtigen, wodurch die Steuerung der Oberflächenchemie und Reaktivität von oligoclusters. Andere Chemikalien, die in diesem Protokoll verwendet werden, können ohne weiteres für ähnliche Chemikalien ersetzt werden, ohne Synthese zu beeinträchtigen. Dazu gehören die Substitution von Borax mit anderen alkalischen Puffern (z.B. Carbonat) und Natriumthiocyanat für andere Thiocyanatsalze (z.B. KSCN).
Das Hauptmerkmal dieses Protokolls ist seine Einfachheit, die hervorgehoben werden müssen. Nur eine Milligramm Waage und Magnetrührer erforderlich Handelsqualität Gold oligoclusters zu produzieren, die für fortgeschrittene biologische und Materialanwendungen verwendet werden kann. Breite Anwendbarkeit ist als und durch Monodispersität hergestellt durch die breite Palette von Größen unterstützt werden. Zusätzlich im Hause ist die Produktion niedrig Kosten.
Die oligoclusters sind besonders wertvoll für die Untersuchung der Permeabilität von Basalmembranen und Blutbarrieren. Sie lassen sich leicht mit Kochsalzlösung durch verschiedene Routen und verfolgt in vivo 19-21 verwaltet werden. Erhalten von Gewebeproben können anschließend unter einem Elektronenmikroskop untersucht werden 16,22. Neben Permeabilität, stellt biologisch Verteilung wertvolle pharmakologische Informationen und die Verwaltung der Mischung aus oligoclusters unterschiedlichen Größen geben wertvolle Informationen über größenabhängige Verteilung der Partikel im Innern des Körpers 23-25. Schließlich wegen ihrer einzigartigen Struktur versagen sie lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) manifestieren vielleicht sie zu idealen Kandidaten für die Fluoreszenzmarkierung zu machen, die nicht ohne weiteres erreichbar in Goldnanopartikel, weil Interferenz zwischen den LSPR und Fluorophore Ergebnisse in nahezu vollständige Löschung der Fluoreszenz 26 .
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Anerkennungen
T. K. # x000a0, erkennt # x000a0, Unterstützung # x000a0, von der # x000a0, Slowenien Research Agency (ARRS gewährt BI-US / 13-14-040 und J3-6803). O. S. Unterstützung # x000a0;; vom National Institute of Health (NIH) Zuschuss RO1HL49277 # x000a0 anerkennt.
Referenzen
Artikel aus Journal of Visualisierte Experimente. JoVE sind hier mit freundlicher Genehmigung von MyJoVE Corporation