JBC Journal of Biological Chemistry

Ras-Proteine ​​sind kleine GTPasen eine zentrale Rolle bei der Zellproliferation und Differenzierung spielen. Ihre Aktivierung ist abhängig von der konkurrierenden Wirkung von GTPase aktivierende Proteine ​​und Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF). Die Eigenschaften von zwei dominant-negativen Mutanten innerhalb der katalytischen Domänen der ras-spezifischer GEF, CDC25 Mm. sind beschrieben. In vitro. die mutierten GEF W1056E und GEF T1184E Proteine ​​sind katalytisch inaktiv, sind in der Lage effizient GEF Wildtyp von p21 ras zu verdrängen. und stark reduziert Affinität des Nucleotid freie ras · GEF-Komplex für die ankommende Nukleotid, was zur Bildung eines stabilen ras · GEF binärer Komplex. Im Einklang mit ihren in vitro-Eigenschaften, bringen die beiden mutierten GEFs eine dramatische Reduktion der ras-abhängigen fos -luciferase Aktivität in Maus-Fibroblasten. Die stabilen ektopischen Expression des mutierten GEF W1056E in glatten Muskelzellen wirksam Wachstumsrate und die DNA-Synthese ohne nachweisbare morphologische Veränderungen reduziert.

Ras-Proteine ​​sind Proteine ​​stark konservierte Guaninnukleotid, mit intrinsischer niedriger GTPase Aktivität ausgestattet ist (1). Ras-Proteine ​​wirken als molekulare Schalter, die Paar membrangebundene Rezeptoren intrazelluläre Signalwege gesteuert Zellwachstum und Differenzierung. Innerhalb der Zellen existieren ras-Proteine ​​entweder in einer GTP-gebundenen ( „Ein“ -Zustand) oder einer GDP-gebundenen ( „Aus“ -Zustand) Form. Die Höhe der aktiven, GTP-gebundenen Form ergibt sich aus dem Gleichgewicht der konkurrierenden Aktivität GTPase aktivierende Proteine ​​und Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF) 1 (in Lit. prüft. 1-4). Onkogene Versionen von p21 ras sind meist in der GTP-gebundenen Form entweder aufgrund einer reduzierten GTPase-Aktivität oder aufgrund eines erhöhten GDP / GTP Austausches gefunden.

Die GEF · ras Zyklus hat ausführlich in den letzten Jahren untersucht worden. Mutations-Analyse von Rückständen in GEF beteiligt · ras Interaktionen gab Einblicke in die Rolle von ras-Reste in Wechselwirkung mit GEF-Molekülen beteiligt (24-27), obwohl viel weniger Informationen über die beteiligten GEF Reste vorhanden war (28-30). Erst im letzten Jahr hat jedoch eine detaillierte kinetische Analyse der GEF · ras-Zyklus (31) und die Struktur eines ras · GEF-Komplex (32) wurde, veröffentlicht für ein besseres Verständnis der komplexen molekularen Ereignisse, die Grundlage Einstellung verantwortlich für ras-Aktivierung durch Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren.

Dominant-negative Mutanten in kleinen G-Proteine ​​als Werkzeuge bei der Signaltransduktion Studien immer beliebter geworden. Doch nur sehr wenige dominant-negative Wechselfaktoren wurden bisher beschrieben. Eine Klasse umfasst GEF-Moleküle in ihren katalytischen Domänen gelöscht, und ihre dominant-negative Eigenschaften sind wahrscheinlich aufgrund unproduktiver zu dem vorgelagerten Regler Bindung, die zu einer Unterbrechung der Signalübertragung und Fehler Ergebnisse ras zu aktivieren. Diese Art der Mutante wurde sowohl SOS (33) und CDC25 Mm (17) beschrieben. Eine zweite und potentiell interessanter dominant-negative Klasse umfasst Mutanten in der katalytischen Domäne, die noch in der Lage ist ras zu binden, aber nicht in der Lage Guanin-Nukleotid-Austausch zu induzieren. Bisher ist nur eine Mutante dieser Klasse wurde in der Hefe GEF CDC25, mit dem einzigen Beweis für diese Mutante, die als ein dominant-negativer Mutante ist eine etwa 2-fache Reduktion der Wachstumsrate in Hefe überexprimiert, das mutiert CDC25 (30) beschrieben .

EXPERIMENTELLE VERFAHREN

Rekombinante und Genmanipulationen

CDC25 Mm PCR von A10 genomischer DNA und CDC25 Mm RT-PCR

Genomische DNA wurde aus mehreren Klonen von A10 embryonale Rattenaortaglattmuskelzellen hergestellt, transfiziert mit pcDNA3 rekombinantes Plasmid, das das mutierte Gen CDC25 MmW1056E gemäß veröffentlichten Protokollen (39) enthält. 1 & mgr; g genomischer DNA aus jedem Klon wurde verwendet, ein CDC25 Mm internes Fragment von etwa 800 Basenpaaren zu amplifizieren. Kurz gesagt, wurde die genomische DNA in 50 & mgr; l PCR-Reaktionsgemisch 5 & mgr; l 10 × PCR-Puffer (Promega, Madison, WI), 3 ul 25 mM MgCl 2 (Promega, Madison, WI), 1 & mgr; l von 2,5 mm Aktien enthalten amplifizierten von dNTPs (Roche Molecular Biochemicals), 50 pmol jeden Primers (5'-CGTGATCTGGTGGACAATAACCG-3 'und 5'-TCGTCTGCTTAGAAACTTTGAGCC-3'), und 0,5 Einheiten von Taq DNA-Polymerase (Promega, Madison WI). Zyklusbedingungen enthielten einen anfänglichen Denaturierungsschritt bei 94 ° C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94ºC für 1 min, 50ºC für 1 min und 72 ° C für 2 min. Die PCR-Reaktionsgemische wurden in 1,5% Agarosegel, gefärbt mit Ethidiumbromid getrennt und sichtbar gemacht. Zelluläre Gesamt-RNA wurde aus Zellen durch das Verfahren der sauren Guanidiumthiocyanat Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert, wie zuvor beschrieben (39). 5 ug Gesamt-RNA aus jeder Probe wurden revers transkribiert in cDNA des ersten Stranges eine RT-PCR-Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Gleiche Mengen an cDNAs wurden unter Verwendung der gleichen Oligonucleotidprimern amplifiziert und die gleichen Reaktionsbedingungen, wie mit dem einzigen Unterschied, die Leistung 40 Zyklen wie oben beschrieben, statt 30.

Transfektion von Maus-Fibroblasten und Bestimmung der fos-Luciferase-Aktivität

NIH3T3 Maus-Fibroblasten wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 10% Serum von neugeborenen Kälbern, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 m m Glutamin ergänzt routinemßig gezüchtet. Die Zellen wurden routinemäßig mit 1 & mgr; g pcDNA3-abgeleitete Plasmide durch das LipofectAMINE Reagenz (Life Technologies, Inc.) transfiziert und kotransfiziert mit 0,33 ug des ras-responsivefos -luciferase Plasmid (21. 40). In allen Transfektionen zu einem Gesamt-DNA wurde aus 1,5 ug mit dem leeren Plasmid pcDNA3 gepuffert. Nach der Transfektion wurden die Zellen für 24 h in serumfreiem Medium, das mit 4 ug / ml Transferrin und 10 -8 m Natriumselenit und gesammelt ergänzt ausgehungert. Falls erforderlich, wurden die Zellen mit 16-18 h stimulieren entweder 100 ng / ml PDGF oder 20% Serum von neugeborenen Kälbern. Luciferase-Aktivität wurde getestet, wie im Wesentlichen beschrieben (21), um das Luciferase-Assay-System mit Reporter-Lysepuffer (Promega) und normalisieren auf Proteingehalt mit dem Bio-Rad-Kit Bradford bestimmt.

Die Transfektion von glatten Muskelzellen und Bestimmung der Zellproliferation

A10 embryonale Rattenaortaglattmuskelzellen (ATCC) wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum (Hyclone), 2 m m l -Glutamin und 50 ug / ml Gentamycinsulfat (Sigma) gezüchtet. Glatte Muskelzellen (A10-Zellen) wurden bei 50% Konfluenz in 100 mm-Durchmesser-Petrischalen transfizierte 45 unter Verwendung von & mgr; l / Schale DOTAP liposomalen Transfektionsreagenz (Roche Molecular Biochemicals). Jede Schale wurde mit 7,5 & mgr; g pcDNA3-abgeleiteten Plasmiden transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen für 48 h wachsen und wurden dann geteilt und in normalen Wachstumsmedium mit 700 ug / ml Geneticin (G418, Sigma) ergänzt platziert. Nach der Auswahl für zwei Wochen wurden einzelne Kolonien isoliert und gezüchtet. Alle ausgewählten Klone wurden in Gegenwart von 700 ug / ml G418 gezüchtet. Um morphologische Analyse durchzuführen, wurden Zellen ausplattiert 5 × 10 3 / cm 2 und kultiviert in normalen Wachstumsmedium für 48 h. Die Zellen wurden dann zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, feste mit Methanol gewaschen und mit Giemsa (Sigma). DNA-Synthese wurde in ruhenden Zellen (0,5% fötales Kälberserum für 31 h) von [3 H] Thymidin-Einbau bestimmt. 18 h; verschiedene Klone wurden mit 0,5 & mgr; Ci von [3 H] Thymidin (Amersham Pharmacia Biotech) in Gegenwart oder Abwesenheit von PDGF (Amersham Pharmacia Biotech 10 ng / ml) markiert. [3 H] Thymidin-Einbau wurde durch Szintillationszählung (Amersham Pharmacia Biotech) bestimmt. Die Zellen wurden in einem Coulter-Zähler gezählt. Verdopplungszeit wurde durch Kurvenanpassung der grafischen Darstellung von Daten, die Anzahl der gezählten Zellen über die Zeit berechnet.

Protein Purification

Wildtyp- und mutierte Fusionsproteine ​​zwischen Glutathion-S-Transferase (GST) und CDC25 Mm 976-1262. ~58 kDa wurden durch Glutathion-Sepharose-Chromatographie (Amersham Pharmacia Biotech) wie zuvor beschrieben (9. 41) gereinigt. Wenn es erforderlich ist, Glutathion-Sepharose-gebundene Fusionsproteine ​​wurden mit Thrombin (Sigma) gespalten und weiter gereinigt durch ResourceQ (Amersham Pharmacia Biotech) Chromatographie im wesentlichen wie beschrieben (42. 43). Rekombinanter N-terminal His-getaggten p21 ras-Protein wurde aus einem E. coli-Stamm gereinigt beherbergt, der einen pQE ™ (Qiagen, Valencia, CA) abgeleitetes Plasmid gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Der binäre Komplex ras · CDC25 Mm wurde hergestellt, indem ein 5-facher molarer Überschuß von p21 ras · GDP in 50 m M Tris-Cl inkubiert, pH 7,5, 10 m m MgCl2. 5 m m Dithioerythrit Puffer 10 m m EDTA mit Wildtyp- oder Mutanten-GST-GEF (pre-gebunden an Glutathion-Sepharose) für 30 min bei Raumtemperatur. Der gebundene Komplex wurde ausgiebig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 14 m m β-Mercaptoethanol, 1 m EDTA, 0,5% Triton X-100 gewaschen. Der Komplex wurde (in 50 mM Tris-Cl, pH 8,5, 50 mm NaCl, 14 mm β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 3 mg / ml) mit reduziertem Glutathion eluiert, dialysiert gegen 50 mM Tris- Cl, pH 7,5, 50 mm NaCl, 14 mm β-Mercaptoethanol, 50% Glycerin) und bei -20 ° C gelagert. Mindestens 70% des GST-GEF-Proteins wurde unter diesen Bedingungen ras p21 gebunden, wie durch Gelelektrophorese beurteilt.

Guaninnucleotid- Austausch und der Zerfall Assays

Die Dissoziationsrate der Ras-markierten Guaninnukleotid-Komplexe und der kalten GDP zu radioaktiv markierten GTP-Austauschreaktionen auf p21 ras wurden durch einen Nitrocellulose-Bindungstest gemessen, wie beschrieben (41). Kurz gesagt wurden die markierten Komplexe durch Inkubation von 1 μ m p21 ras-Protein in Puffer A (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM MgCl2. 100 mm NH4 Cl, 1 mg / ml Rinderserumalbumin) für 10 min hergestellt, bei 30 ° C mit 3 mm EDTA und 20 μ m [3 H] GDP (10,1 Ci mmol -1. Amersham Pharmacia Biotech). MgCl2 (3 m m) wurde dann zugegeben. Die Dissoziationsrate dieser Komplexe (Endkonzentration: 0,2 μ m in Puffer A) wurde nach der Zugabe eines 5000-fachen Überschuß an unmarkiertem Nucleotid- und die entsprechende Konzentration des Wildtyp oder mutiertem Austauschfaktor bei 30 ° C gemessen. Für die kalte GDP zu [3 H] GTP-Austauschreaktion, 0,2 μ m p21 ras-Proteine ​​wurden bei 30 ° C in Puffer A inkubiert, und die Reaktion wurde durch die Zugabe von 2 μ m [3 H] GTP (7,0 Ci mmol Schritten - 1). p21 ras -gebundenen Radioaktivität auf 15 & mgr; l-Proben gefiltert durch Nitrocellulosescheiben (Millipore, 0,45 & mgr; m), die mit 6 ml eiskaltem Puffer A gewaschen wurden zweimal ermittelt wurde 10 m m MgCl2 enthält. Die zurückgehaltene Radioaktivität wurde in einem Packard-Flüssigszintillationszähler gemessen. In den Standard-Dissoziation und Austauschtests wurden Austauschfaktoren um 1:10 Molverhältnis mit p21 ras, d.h verwendet. bei 0,02 μ m Endkonzentration. Zur Bestimmung der nicht-katalytischen Dissoziationsraten wurde GEF-Konzentration auf das 30-fache erhöht, das heißt in einem 3: 1-Molverhältnis mit p21 ras.

Dissoziation der Nucleotid freie ras · GEF Complex von Guaninnukleotiden

Nucleotid Dissoziation der p21 ras / GST-CDC25 Mm Komplexe wurde wie folgt getestet. 100 n m von jedem der gereinigten Komplexe wurde mit verschiedenen Konzentrationen Nucleotid in 50 m M Tris-Cl, pH 7,5, 50 m m KCl, 5 m m MgCl2 inkubiert. und 5 m m β-Mercaptoethanol bei 4 ° C für 15 min und man ließ sie binden an Glutathion-Sepharose-Kügelchen. Nach ausgiebigem Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4, die an die Kügelchen gebundenen Proteine ​​wurden in Probenpuffer, durch SDS-PAGE, auf Nitrocellulose übertragen und einem Immunoblot auf die Anwesenheit von p21 ras und CDC25 Mm Assoziation von der zu detektieren getrennt solubilisiert p21 ras und CDC25 Mm Proteinen. Sowohl anti-ras und anti-CDC25 Mm-Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Peroxidase-konjugierte sekundäre Antikörper wurden fromZymed. Gebundene Antikörper wurden mit ECL (Amersham Pharmacia Biotech) visualisiert.

Die Bindung von Fluorescent Guaninnukleotiden den Nucleotid freien ras · GEF

Guanine Nucleotide trägt DANN -methylanthraniloy (mant) Gruppe auf Ribose (mant Nukleotiden) wurden von Molecular Probes (Eugene, OR) gekauft. Alle Messungen wurden bei 20 ° C in 50 m M Tris-Cl, pH 7,5, 10 m m MgCl2 durchgeführt. und 5 m m Dithioerythrit Puffer einen Jasco FP-777-Fluorometer bei einer Anregungswellenlänge von 366 nm und einer Emissionswellenlänge von 442 nm verwendet wird.