PCambia Vektoren - Cambia - Enabling Innovation

Ein großer Teil der Informationen beziehen sich unten an ältere pCAMBIA Vektoren

Pflanzentransformation ist jetzt Routine in Hunderten von Laboratorien weltweit, mit bakteriell vermittelten oder direkten DNA-Transferverfahren wie Bombardement. Diese Methoden haben sowohl technische als auch geistige Eigentum Einschränkungen (siehe BioForge TransBacter Projekt., In dem wir sind die Alternative zu Agrobacterium-Transformation für mehr völlige Freiheit Verbesserung zu arbeiten). Eines der größten Gesicht technischen Einschränkungen Labors ist, dass viele Vektoren verwendet noch historische Relikte mit minderwertigen Eigenschaften, die DNA-Konstruktionen umständlich oder mühsam machen:

Das pCAMBIA Vektorgerüst wird aus dem pPZP Vektoren (- Maliga, siehe Referenzen von Hajdukiewicz, Svab konstruiert) abgeleitet. Zwar nicht perfekt und Grenzen technischer und IP mit (s. Das BioForge GUSPlus Projekt, in dem wir sind Reportergene und Auswahlmethoden zu verbessern, um weitere völlige Freiheit zu betreiben), bieten pCAMBIA Vektoren:

Ein paar Punkte über die pCAMBIA Klonierungsstrategie:

Nomenclature of pCAMBIA Vektoren:

Das vierstellige Zahlensystem funktioniert wie folgt:

Erste Stelle - zeigt an Pflanzenauswahl: 0 für Abwesenheit; 1 für Hygromycin-Resistenz; 2 für Kanamycin; und 3 für die Phosphinothricin (die Vektoren die Phosphinothricin-Resistenzgen enthalten, sind nicht mehr verfügbar von CAMBIA auf Wunsch von Bayer, die Patente beschränken seine Verwendung in einigen Ländern besitzt).

Zweite Ziffer - zeigt bakterielle Auswahl: 1 für Spectinomycin / Streptomycin-Resistenz; 2 für Chloramphenicol; 3 für Kanamycin; 4 für spec / strep und Kanamycin.

Dritte Stelle - zeigt Polylinker verwendet: 0 für pUC18 Polylinker; 8 für pUC8-Polylinkers; 9 für pUC9 Polylinker.

Vierte Ziffer - zeigt Reportergen (s) vorhanden ist: 0 für keinen Reportergen; 1 für E.coli gusA; 2 für mGFP 5; 3 für gusA: mGFP 5 Fusion; 4 für mgfp5: gusA fusion; 5 für Staphylococcus sp. gusA (GUSPlus).

Fünfte Stelle - stellt fest, eine andere Besonderheit. Bisher hat diese verwendet nur mit: pCAMBIA1305.1 und Plasmide daraus abgeleitet, wobei die 0,1 das Fehlen eines Signalpeptid aus dem GUSPlus ™ Protein bezeichnet; und wo die pCAMBIA1305.2 .2 die Anwesenheit des GRP-Signalpeptid bezeichnet in planta Sekretion des GUSPlus ™ Protein.

Nacheilende letter - X zeigt an, dass das Reportergen sein eigenes Startcodon fehlt, und der Vektor für Fusionen mit dem Reporter zu schaffen; Z zeigt das Vorhandensein eines funktionellen Lacza für Blau-Weiß-Screening; a / b / c gibt an, für Fusionen mit der Sicherung und Verwenden Vektoren den Leserahmen.

Vector Handbuch Nachtrag: Wichtiger Hinweis zu pCAMBIA Benutzer

Dieser Vektor ist ein Teil einer neuen Serie von pCAMBIA GT-BACK-Vektoren (Gentransfers Bakterielle Acquired Kompetenz mit Kanamycin-Selektion), der eine modifizierte Version des pCAMBIA 1105,1 und ein Fragment des Ti-Plasmids (abgeleitet von pTiBo542) umfasst, die nur die virA , virB, Virc, virD, Vire, virG, Virk - virJ Operons. Diese neue unitäre Vektor erlaubt die DNA-Übertragung in Fähigkeit und stabilisierte bewegt zu werden, ein viel breiteres Spektrum von Bakterien, und es wird als Open-Source-Toolkit bereitgestellt werden.
Die Mehrwertmerkmale des neuen Vektors über die Transbacter Technologie sind:
- Es kann als Fleck verdünnten DNA auf dem Papier verteilt werden (beispielsweise auf einem Brief) die Notwendigkeit, für die Einhaltung der Einfuhrkontrollen auf lebende Organismen und anderen Quarantäne Probleme zu beseitigen. Dies ist das Mittel, mit denen buchstäblich Tausende von Labors weltweit erhalten haben (und weiter verschickt) pCAMBIA Vektorsätze.
- GT-Back-Vektor fehlt die RK2 abgeleitet oriT die Transbacter getragen, wodurch Beseitigung oder Verringerung der Fähigkeit des Plasmids durch Konjugation RK Funktionen konjugiert und transmissible auf andere Hosts werden.
- Es hat einen breiten Wirtsbereich-Replikationsursprung von pVS1 ermöglicht viel breiteres Spektrum von Bakterien als Gentransfervektoren untersucht werden, so dass Entscheidungen von gutartigen Symbionten, die auf Pflanzen physikalische oder genetische Belastungen nicht verhängen.

Wenn Sie CAMBIA Materialien bitte anmelden, diskutieren oder abfragen wollen, die

pCAMBIA0380; pCAMBIA0390

pCAMBIA1200; pCAMBIA1300; pCAMBIA1380; pCAMBIA1390; pCAMBIA2200; pCAMBIA2300

Forscher die neuesten Versionen wollen sollten sehen pCAMBIA 1305,1, pCAMBIA1105.1 oder pCAMBIA 1305,2. die kann durch das BioForge GUSPlus Projekt angefordert werden. Informationen zu dem älteren pCAMBIA Vektoren sind hier für die Bequemlichkeit.

Diese Vektoren enthalten minimal heterologe Sequenzen für die Pflanzentransformation und Selektion von Transformanten; sie erlauben Insertion gewünschter Gene für die Transformation in Pflanzen, sondern erfordern alle Promotor- und Terminatorsequenzen für das Pflanzen Expression klonierter Gene neu.

pCAMBIA1380 und 1390 basieren auf pCAMBIA1300, aber das pUC18 Polylinker-Lacza Fragment wurde mit dem einfacheren pUC8 gelöscht und ersetzt (1380) und pUC9 (1390) Polylinker, die enthalten keine potentiell Start Verwechselung oder Stopp-Codons. Das vollständige modulare Format wird für die bequeme PCR-Klonierung und Genexpression zur Verfügung gestellt.

Für Forscher Promotoranalyse die Verwendung des Minimalvektor durchführt, enthaltend GUSPlus (pCAMBIA 0.305,2., Die durch das Projekt BioForge GUSPlus bestellt werden kann) wird empfohlen, eher als eine der anderen pCAMBIA Vektoren. Co-Transformationsstrategien sind wünschenswert, physikalisch in der transformierten Pflanzengenom der Pflanze Selektionsgen den Promotor zu trennen (meist 35S) und der Promotor von Interesse (oft viel schwächer oder spezifischere) eine gus oder andere Reportergen antreibt. Die Art und Weise, die wir tun dies schon seit Jahren ist, dass zwei Vektoren getrennt in den gleichen Stamm von Agrobacterium transformiert werden (oder mehr Stämmen bevorzugt aus dem BioForge TransBacter Projekt. Für die Freiheit zu arbeiten), aber offensichtlich Co-Transformation kann auch durch getan werden Transformieren gleichzeitig mit zwei getrennten Isolate jeweils einer der Vektoren enthalten. Bei der Verwendung von einem Isolat, werden einzelne Kolonien ausgewählt, analysierte der Plasmid-DNA, die auf spezielle Medien induzierten Zellen (wenn für die Pflanzenart erforderlich), und die zwei Zelllinien werden zusammen sofort gemischt vor der Aufbringung auf die Pflanzengewebe transformiert werden. In unseren Händen gibt diese Methode 10-30% der transformierten Pflanzenlinien, die sowohl T-DNAs.

pCAMBIA1201; pCAMBIA1301; pCAMBIA2201; pCAMBIA2301

Diese Vektoren enthalten eine voll funktionsfähige gus A Reporter für eine einfache und empfindliche Analyse der Genfunktion oder Anwesenheit in regenerierten Pflanzen durch GUS-Assay konstruieren. Das Konstrukt verwendet E. coli gusA - mit einem Intron (aus Rizinus Katalase-Gen) innerhalb der codierenden Sequenz (N358Q N-gebundene Glykosylierung zu verhindern), dass die Expression von Glucuronidase-Aktivität, um sicherzustellen, ist aus eukaryotischen Zellen stammt, nicht von der Expression von Rest A.tumefaciens Zellen. Die gusA-Reportergen werden in neuem modularem Format kloniert. Diese Plasmide eignen sich für die Insertion anderer Gene von Interesse ihren eigenen Promotor und -Terminator enthält. Forscher können die gusA- Gen auszuschneiden und ihr eigenes Gen von Interesse an seiner Stelle einfügen oder diese Vektoren verwenden Fusionen von gusA- mit ihren Gen von Interesse zu erstellen (wenn Sie einen pCAMBIA Vektor-Derivat geschaffen haben, dass andere Forscher nützlich finden und teilen möchten es, lass es uns wissen). Diese Vektoren enthalten den pUC18 Polylinker-Lacza und die gleichen bakteriellen und pflanzlichen Selektionsgene wie die entsprechenden Selektionsvektoren Minimal.

pCAMBIA1302; pCAMBIA1303; pCAMBIA1304

Für diejenigen, das Beste aus beiden Welten in Reportergen Wunsch konstruierten wir diese Vektoren, ähnlich in Dienstprogramm mit der GUS-Intron Auswahl Vektoren (GIS), aber einschließlich GFP. ein nicht-katalytisches Protein ist, stellt eine intrinsische Begrenzung Nachweisempfindlichkeit mit fluoreszierenden Proteinen und teure Ausrüstung für die quantitative Assays und mikroskopische Beobachtung benötigt werden. GFP ist dennoch populär als Reporter-Gen und wir liefern es in voller neue modulare Format für die geklonte die es nutzen wollen.

Die Analyse einer großen Anzahl von Transformanten von Reis und Arabidopsis bei CAMBIA zeigte, dass die Fluoreszenz durch das MGFP5 Protein produziert war ziemlich schwach. Als Folge davon aufgebaut unsere Forscher ähnliche Konstrukte, die das EGFP-Gen von Clontech erhältlich verwenden. Die Ergebnisse mit diesen Proteinen waren weit überlegen, und obwohl wir Vektoren, die dieses Gen verteilen nicht in der Lage sind, empfehlen wir, dass Forscher pEGFP von Clontech kaufen und verwenden diese ihre eigenen Plasmide analog zu pCAMBIA1302, pCAMBIA1303 oder pCAMBIA1304 zu konstruieren.

pCAMBIA1381 und 1391 und deren Xa, b, c ORF-Varianten

Entwickelt, um gus A als echter Reporter der Genexpression durch Fusion Konstruktion, diese Vektoren sind abgeleitet von pCAMBIA1380 und 1390, und enthält ein promotorloses, nicht-Intron gus A (N358Q) Gene (ohne einen Startcodon) in drei Leserahmen zu nutzen, und entweder mit pUC8 oder pUC9 orientierten Polylinker. Dies ermöglicht eine einfache Konstruktion von Carboxy-Terminus Protein-Fusionen zu gusA-. Pflanzenauswahl ist mit Hygromycin und bakterielle Selektion mit Kanamycin.

pCAMBIA1281Z; pCAMBIA1291Z; pCAMBIA1381Z; pCAMBIA1391Z

Für Tests Promotor in planta. Diese Vektoren sind mit einer promotorlosen Version von gus A (N358Q) mit der Katalase Introns unmittelbar stromabwärts eines abgestumpften Lacza entweder den pUC8 oder pUC9 Polylinker enthält. Alle Plasmide, die in dieser Serie haben Hygromycin als Pflanzen Selektionsgen und bakterielle Selektion ist entweder mit Chloramphenicol (1281Z, 1291Z) oder Kanamycin (1381Z, 1391Z) erhältlich. Das verkürzte Lacza ist funktionsfähig für Blau / Weiß-Screening von Klonen in geeigneten E.coli Wirtsstämmen.

Um diese 35S-Störungen zu vermeiden von Promotoranalysen, empfehlen wir die Verwendung Cotransformation Strategien, wie oben in dem Abschnitt über die Minimal-Auswahl Vektoren beschrieben.

In einer solchen Strategie kann der Promotor von Interesse in einem unserer Promoter Cloner Vektoren geklont werden, aber dies sollte zunächst durch die Durchführung einer Smal modifiziert werden - XmnI doppelte Spaltung, Gelreinigung des großen (

8,9 KB) Backbone-Fragment und Selbstbindung. Ein solcher Vektor kann pCAMBIA0381Z genannt werden, aber wir haben es nie gebaut für den Vertrieb als Teil des pCAMBIA Vektor-Kit.

Genotypen von einigen nützlichen Agrobacterium tumefaciens-Stämme

Antibiotika

Chloramphenicol, 100 ug / ml für den Stamm AGL1, 10 ug / ml für LBA4404, 25 & mgr; g / ml für EHA105 und für E. coli.
Kanamycin, 50 ug / ml für beide Agrobacterium und E. coli.
Für die Selektion von transformierten Reispflanzen verwenden wir Hygromycin bei 50 ug / ml und 25 ug / ml für Tabak.

Deblaere R, Reynaerts A, Hofte H, Hernalsteens JP, Leemans J, Van Montagu und M (1987) Vektoren für die Clonierung in Pflanzenzellen. Meth Enzymol 153: 277-292

Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA (1983) Binäre Vektor-Strategie basiert auf Trennung von vir- und T-Region des Agrobacterium tumefaciens-Ti-Plasmid. Nature 303: 179-180

Hood EE, Helmer GL, Fraley RT, Chilton MD (1986) The hypervirulence von Agrobacterium tumefaciens A281 ist in einem Bereich von pTiBo542 codiert außerhalb der T-DNA. J Bac 168: 1291-1301

Peralta EG, Hellmiss R, Ream W (1986), Overdrive, ein T-DNA-Übertragung-Enhancer auf der A. tumefaciens-tumorinduzierenden Plasmid. EMBO J 5: 1137-1142

Andere Ressourcen

Zurück ◈ Weiter