Protokoll Reverse-Dot-Blot (RDB)
Reverse-Dot-Blot (RDB)
Reverse-Dot-Blot-Analyse ist ein Verfahren, zur Immobilisierung von allelspezifischen Oligonukleotidsonden auf einer Nylonmembran, anstatt die einzelnen DNA-Proben. Dies ist ein nicht-radioaktiven Verfahren. In diesem Format sind mehrere Paare von mutanten und normalen ASO Sonden auf Streifen aus Nylonmembranen getüpfelt. Für jeden Diagnosetest, ein beschmutzter Streifen vielen normalen und mutierten Oligonucleotiden enthält, mit einer spezifischen DNA-Sonde hybridisierte viele Mutationen zu screenen. Reverse-Dot-Blot-Analyse wurde zuerst von Saiki et al (22) beschrieben, und dann später viele entwickelte β-Thalassämie-Mutationen in der sizilianischen Bevölkerung und für den Einsatz in der pränatalen Diagnostik (23,24) zu screenen.
Der Reverse-Dot-Blot können die meisten gewöhnliche und ungewöhnliche spezifischen Mutationen in einem bestimmten Land vorhanden erkennen, nachdem die Bedingungen sorgfältig Set-up. Kein einziges RDB kann alle Mutationen in jedem Land abdecken. RDB ist auch in Sizilien verwendet α-Thalassämie (25) und δ-Thalassämie Punktmutationen zu analysieren, und für die Genotypisierung der Haupt β-Globin-Gen-Varianten (HBS, HBC HbD, etc). Ein allgemeiner Überblick des Verfahrens beschrieben.
- Die amplifizierte DNA wird unter Verwendung von markierten 5'-modifizierte Primer mit Biotin oder während der Verstärkung durch Biotin-16-dUTP.
- Oligonukleotidsonden sind 5' aminomodifizierten. A NH2-Gruppe wird im letzten Schritt der Synthese zugegeben.
- Membran (Biodyne-C, PALL-Biosupport) durch EDC aktiviert und die Oligonucleotidsonde wird auf der Oberfläche der Membran getupft eine 2 & mgr; l-Pipette. Auf der linken und auf der rechten Seite der gleichen Spur sind die normalen und die mutierten Oligonukleotiden gesichtet.
- Nach der Inaktivierung der Membran, ist es bei 45 o C für 15 min vorhybridisiert
- Amplifizierte DNA wird für 10 Minuten in Hybridisierungslösung denaturiert und bei 95 o C, verdünnt. Dann wird auf den Pre-hybridisierte Membran hinzugefügt.
- Die Membranen werden für 60 min inkubiert. bei 45 o C und dann 20 min bei 45 o C gewaschen
- Konjugationsschritt mit Streptavidin-AP wird 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Die Membranen werden für 15 min bei Raumtemperatur gewaschen.
- Schließlich werden die Filter in einer Lösung, die NBT / BCIP inkubiert und die Farbe wird in 30-45 min entwickelt.
Eine kritische Anforderung dieses Assays ist die Optimierung der einzelnen Waschtemperatur für alle Sonden. Diese Anforderung wird am besten gesteuert durch die Länge und die Menge jeden Oligonukleotidsonde zu optimieren. Dies erfordert in der Regel die Synthese und Erprobung von vielen Sonden. In einem gewissen Fall ist die Addition oder die Deletion eines einzelnen Nukleotids aus der Sequenz des Oligonukleotidsonde für die korrekte Eingabe kritisch. Die Membranstreifen der kovalent gebundenen Oligonukleotidsonden enthalten, können für sechs Monate bei Raumtemperatur für die Verwendung in großen Chargen und gespeichert bereit, hergestellt werden.
Interpretation der Ergebnisse
Es ist wichtig zu betonen, dass es eine Unterscheidung zwischen falsch positiv sein aufgrund von Hintergrundsignalen und den wahren positiven Ergebnisse der Kontrollproben. Im Zweifelsfall sollte der Test immer wiederholt werden. Die Strategie, wie mit ARMS-PCR wird für die gemeinsame Mutationen auf einer Membran zu durchmustern, und dann, wenn kein positives Ergebnis erhalten wird, werden die für seltene auf einer zweite Membranen gescreent. Jede Mutation verbleibenden nicht identifizierten wird dann durch direkte Sequenzierung untersucht.
Abbildung 5.2 zeigt die Hauptschritte veranschaulicht, bei der Erzeugung eines Reverse-Dot-Blot unter Verwendung von immobilisiertem ASO-Sonde beteiligt.
Abbildung 5.3 zeigt RDB für die 7 häufigsten Mutationen verwendet wird in Sizilien gefunden zu screenen (wie in Tabelle 5.3 aufgeführt). Diese machen 95% der β-Thalassämie Defekte in Sizilien.
Abbildung 5.4 zeigt RDB für die pränatale Diagnostik von β-Thalassämie in Labor Dr. Maggio in Sizilien verwendet wird.
Figuren 5.5 und 5.6 zeigen RDB verwendeten α-Thalassämie und δ- Thalassämie Punktmutationen in Dr. Maggio Labor nachzuweisen.