Protokoll Dot-Blot-Schachbrett-Titration von Antikörpern - Advansta Inc
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Dies sind allgemeine Richtlinien und Protokolle für die Dot-Blots durchführt, entweder durch eine Mikrofiltrationseinheit oder durch manuell Protein auf eine Membran Spek.
Dot-Blots sind ähnlich wie Western-Blots, jedoch sind die Proteine nicht elektrophoretisch getrennt, bevor auf eine Membran übertragen, sondern werden stattdessen direkt auf eine Membran getupft. Da Proteine nicht zuerst mit einem Gel aufgetrennt, Dot-Blots können nicht verwendet werden, um das Molekulargewicht eines Proteins zu bestimmen, noch können sie unterscheiden zwischen alternativen Formen des Proteins (z.B. gespaltenen Proteinen). Wenn jedoch die Integrität und Identität des Proteins bekannt ist, kann der Dot-Blot-Substrate verwendet werden für die Titration von Antikörpern zur Verfügung zu stellen.
Im Handel erhältliche Einheiten für Dot-Blotting
Dot-Blots können unter Verwendung von im Handel erhältlichen Geräten durchgeführt werden, die oft als Mikrofiltrationseinheiten. Mikrofiltrationseinheiten bieten eine einfache Handhabung als Protein Blotting, Inkubationen und Waschungen können alle innerhalb der Einheit durchgeführt werden, die jeden einzelnen Blot-Isolaten.
Dot Blots kann auch ohne die Hilfe einer Mikrofiltrationseinheit durchgeführt werden. In diesem Fall wird Protein manuell auf die Membran in einer Reihe von kleinen Punkten ausgemacht. Die Region jeden Punkt enthält, muß dann einzeln ausgeschnitten und getrennt für Inkubationen und Waschungen behandelt.
Proben für Dot-Blots
Proteinproben für Titrieren Antikörper sollten das Protein von Interesse in Hülle und Fülle enthalten. Rekombinantes Protein ist ideal, aber Zelllysaten stark exprimiert Protein enthält, kann ebenfalls verwendet werden.
Negative Kontrollproben können ebenfalls enthalten sein, insbesondere dann, wenn Zelllysaten verwendet werden. Negative Kontrollproben werden bestimmen, ob ein beobachtetes Signal zu unspezifischen Kreuzreaktivität zurückzuführen ist.
Vorbereitung der Proben
Obwohl die Probenvorbereitung für Dot-Blotting ähnlich ist die Vorbereitung für die traditionelle Western-Blot zu probieren, sollten mehrere Faktoren im Auge behalten werden. Diese gelten sowohl für bei der Verwendung von Mikrofiltrationseinheiten oder wenn das Protein manuell Spek.
- Bereiten genug Probe in einem ausreichenden Volumen alle Bedingungen aufzunehmen, die getestet
- Bereitet keine Proben in Puffer enthaltenden Waschmitteln, da sie die Bindung des Proteins an die Membran hemmt
- Wenn Reinigungsmittel vorhanden sind, verdünnen Sie die Proben mit Puffer
- Wenn eine Probe Ausfällungen enthält, Zentrifugieren der Probe und beziehen sich nur um den Überstand zu verhindern, zu Membranverstopfungs
- Verdünnte viskose Proben in Puffer
Dot-Blot-Diagramm / Bedingungen
Die folgenden Richtlinien sollten befolgt werden, wenn das Experiment Planung:
Dot-Blot-Verfahren, um eine kommerzielle Vorrichtung verwendet
Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zur Einrichtung und bereiten das Gerät.
- Anwenden der Probe in einem Volumen groß genug, um die freiliegenden Membran in jeder Vertiefung abzudecken
- Wenden Probe in der Mitte des Brunnens vorsichtig zu schaffen Luftblasen zu vermeiden
- Nicht mehr als Bindungskapazität des Membran
- Verschließen Sie die nicht verwendeten Wells, indem sie mit Probenpuffer füllen
- Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, die Probe durch die Membran zu ziehen, um die unter Verwendung von Vakuum
- Führen Sie Waschungen und Inkubationen nach den Richtlinien des Herstellers
- Entfernen Membran von der Einheit durchzuführen und ECL-Nachweis unter Verwendung eines Standard-Kit
Dot-Blot-Verfahren eines manuelles Spek-Verfahren
Ein manuelles dot blot Verfahren folgt das gleiche Prinzip wie bei einer Dot-Blot-Vorrichtung verwendet wird, aber die Bereiche, in denen die Proteine entdeckt werden müssen, indem ein Gitter auf der Membranen abgegrenzt werden. Durch Probendiffusion müssen kleinere Mengen verwendet werden, wenn manuell Proteine Spek. Nach dem Blotten Proben physikalisch getrennt vor der Inkubation mit den Antikörpern durch Schneiden des Membran werden muß.